1.熒光技術(shù)

（1）熒光原理

熒光分子吸收入射光能量后,電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)電子不穩(wěn)定,會自發(fā)躍遷回基態(tài),并輻射熒光。輻射熒光λ＜入射光λ。

（2）熒光探針

    ①熒光素     如:羅丹明B

    ②熒光蛋白   如:綠色熒光蛋白（GFP）

（3）熒光分類

    ①自發(fā)熒光:如葉綠素、血紅素等熒光分子經(jīng)紫外線照射后,能夠自發(fā)輻射紅色熒光。

    ②誘發(fā)熒光:物質(zhì)經(jīng)熒光染料染色后,再經(jīng)紫外線照射,進(jìn)而輻射熒光。

2.熒光顯微鏡

（1）熒光顯微鏡概述

熒光顯微鏡是指利用短波長電磁波為光源,激發(fā)樣品輻射熒光,之后利用樣品產(chǎn)生的自發(fā)熒光或誘發(fā)熒光,對細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位研究的裝置。

（2）熒光顯微鏡的特殊構(gòu)件

①石英透鏡

②濾光片系統(tǒng)

激發(fā)濾片,位于光源與樣品之間,濾過可見光,只允許作為光源的紫外光通過。

阻斷濾片,位于物鏡與目鏡之間,只允許熒光分子產(chǎn)生的熒光通過。

（3）熒光顯微鏡的特點

①優(yōu)點:熒光顯微鏡主要用于定性、定位研究細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)?？梢杂^察活細(xì)胞。

②缺點:無法排除來自樣品焦平面以外的熒光,使得圖像的反差與分辨率降低。

3.激光掃描共焦顯微鏡

（1）激光掃描共聚焦顯微鏡概述

激光掃描共焦顯微鏡是指以激光為光源,對樣品進(jìn)行逐點、逐行、逐面掃描成像的裝置。其物鏡與聚光鏡共焦點,以提高分辨率。通過調(diào)節(jié)焦平面即可獲得樣品不同層次的圖像,通過計算機分析和模擬,可以構(gòu)筑樣品的三維圖像。

（2）激光掃描共焦顯微鏡的成像原理

    ①光源為激光,經(jīng)雙色鏡反射后,通過物鏡匯聚于樣品某一焦點,激發(fā)熒光。樣品所激發(fā)的熒光經(jīng)透鏡匯聚成像,通過共焦小孔被檢測器檢出。

    ②物鏡與聚光鏡共焦點,使得只有從樣品焦平面發(fā)出的熒光聚焦成像,其他部分的激發(fā)熒光不能通過共焦小孔,檢測器不能檢出。

（3）激光掃描共焦顯微鏡的特點

    ①分辨率比普通熒光顯微鏡提高1.5倍。

    ②通過改變焦平面,可以獲得樣品不同層次的圖像,從而可以構(gòu)筑樣品的三維圖像。

    ③可以實現(xiàn)長時間活細(xì)胞動態(tài)觀察。

 

一、透射電子顯微鏡

1.透射電子顯微鏡概述

    透射電子顯微鏡（TEM）是指利用電子槍發(fā)出的高能電子束照射超薄樣品,透射電子經(jīng)電磁透鏡多次放大后成像的裝置。其原理為樣品不同部分對電子束的散射程度不同。主要用于觀察樣品精細(xì)結(jié)構(gòu)

    透射電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)是指電鏡處于最佳狀態(tài)時的分辨率。

2.透射電子顯微鏡的基本構(gòu)造

（1）照明系統(tǒng):電子槍、聚光鏡

（2）成像系統(tǒng):電磁透鏡（物鏡、中間鏡、投影鏡等）

（3）真空系統(tǒng)

（4）記錄系統(tǒng):熒光屏 or 感光底片

3.透射電子顯微鏡的樣品制備

（1）超薄切片技術(shù):固定→包埋→切片→染色

①固定:使樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)盡可能不發(fā)生變化。

固定劑的種類:鋨酸、戊二醛、高錳酸鉀

②包埋:使樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)在切片中得到支撐,獲得的超薄切片連續(xù)完整并有足夠的強度,耐電子轟擊、耐高溫、耐真空蒸發(fā)。包埋前常需脫水處理。

包埋劑的要求:

A.高倍放大時不顯示本身結(jié)構(gòu)

B.聚合時不發(fā)生明顯收縮

C.具有良好的機械性能

包埋劑的種類:環(huán)氧樹脂

③切片:切片厚度的調(diào)控通常通過金屬熱膨脹或機械伸縮。

④染色:通常通過重金屬鹽對樣品染色以形成明暗差,得到黑白圖像。

常用重金屬鹽

A.鋨酸 - 脂質(zhì)

B.鉛鹽 - 蛋白質(zhì)

C.醋酸鈾 - 核酸

（2）負(fù)染色技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)是指對背景染色的技術(shù)。通過用重金屬鹽對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色,使電子密度高的重金屬鹽布滿整個載網(wǎng),而凸出載網(wǎng)表面的樣品則沒有染料沉積,從而使背景散射電子能力增強,而樣品散射電子能力減弱,以此襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

負(fù)染色技術(shù)適合于觀察生物大分子組成的結(jié)構(gòu),如:病毒、核糖體等。

（3）冰凍刻蝕技術(shù)

冰凍刻蝕技術(shù)主要用于觀察膜斷面表面形貌與膜斷面蛋白質(zhì),樣品無需包埋、固定,能夠更好的反應(yīng)樣品的真實結(jié)構(gòu)。

①冰凍斷裂:在液氮中將樣品迅速冷凍,之后在低溫、真空環(huán)境下用冰刀將其切斷。由于斷面的冰在真空中少量升華,可以增強刻蝕效果。

②刻蝕復(fù)型:用金屬鉑進(jìn)行傾斜噴涂,以形成電子反差,再用碳垂直于斷面進(jìn)行真空噴涂,形成連續(xù)碳膜,以復(fù)制樣品的表面形貌。再用消化液消除樣品本身,之后將之移到載網(wǎng)上用電鏡觀察。

 

二、掃描電子顯微鏡

1.掃描電子顯微鏡概述

掃描電子顯微鏡（SEM）是指利用高能電子束掃描樣品,激發(fā)樣品表面產(chǎn)生二次電子,進(jìn)而依據(jù)樣品不同部位產(chǎn)生二次電子數(shù)量的多少而成像的裝置。主要用于觀察樣品表面形貌。

2.掃描電子顯微鏡的樣品制備

（1）噴鍍技術(shù)

在樣品表面噴涂一層金膜,以增強其導(dǎo)電性。

（2）CO2臨界點干燥法

將樣品浸入液態(tài)CO2中,在臨界溫度之上使CO2以氣態(tài)逸出,由于沒有氣液相面產(chǎn)生,因此不存在表面張力,故能夠保持樣品的表面形貌。

 

1.相差顯微鏡

（1）相差顯微鏡概述

相差顯微鏡是指利用光線的干涉、衍射特征,使相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?增強樣品的明暗對比,從而觀察無色透明樣品的裝置。

（2）相差顯微鏡的特殊構(gòu)件:相差板、環(huán)狀光闌

相差顯微鏡在物鏡后裝有相差板,相差板部分區(qū)域有吸光物質(zhì),使得光線分別通過相差板不同區(qū)域時相位差增大,匯聚后經(jīng)疊加使振幅增大或減小。從而將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?增強樣品的明暗對比。

（3）相差顯微鏡的優(yōu)點:樣品無需染色,可觀察活細(xì)胞及細(xì)胞器動態(tài)。

2.微分干涉顯微鏡

（1）微分干涉顯微鏡概述

微分干涉顯微鏡是指以平面偏光為光源,光源經(jīng)棱鏡后分為兩束,在不同時間經(jīng)過樣品相鄰部位,再經(jīng)過另一棱鏡后會合,從而使樣品的厚度差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?增強樣品的明暗對比,從而觀察無色透明樣品的裝置。

（2）微分干涉顯微鏡的優(yōu)點

    ①適合觀察活細(xì)胞內(nèi)較大的細(xì)胞器。

    ②分辨率比普通復(fù)式顯微鏡提高一個數(shù)量級。

3.錄像增差顯微鏡

錄像增差顯微鏡是指:在微分干涉顯微鏡的基礎(chǔ)上引入計算機輔助錄像,從而觀察記錄活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器活動的裝置。如:顆粒在微管上運動。