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什么是螢光原位雜交技術

螢光原位雜合技術
螢光原位雜合技術(FISH)是一種細胞遺傳學技術,可以用來檢測基因體上面特定核苷酸序列的存在,亦可藉由檢測信使RNA(mRNA)的表現(xiàn)量來觀測基因的表現(xiàn)。其基本原理如圖一所示:在小片段的DNA探針上以缺口轉化法(nick translation)標定Dig-dUTP或Biotin-dUTP,接著取一片經(jīng)由福馬林固定好的組織切片,將帶有標定的單股DNA探針與之進行雜合,完成之后使用螢光標定的Anti-Dig/Biotin抗體進行檢測。此抗體會專一性結合上樣本中已經(jīng)被Dig/Biotin標記引子雜合的核酸,螢光標定的抗體可在螢光顯微鏡下被觀測螢光

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圖解:FISH機制示意圖
相比于傳統(tǒng)用于檢測DNA/RNA存在或表現(xiàn)量的PCR,RT-PCR或real-time PCR等技術,F(xiàn)ISH存在以下特色:
1.其檢測方式為直接將探針送入固定好的細胞/組織中進行檢測,比起將核酸取出的PCR檢測方式,F(xiàn)ISH除了偵測表現(xiàn)量的變化之外,更能夠?qū)δ繕撕怂嵝蛄性诩毎麅?nèi)或是組織內(nèi)的分布有視覺性的直接觀察。
2.PCR產(chǎn)物需要用膠體電泳的方式觀察。引子對間可能的相互干擾或是相似的產(chǎn)物大小會嚴重影響結果的觀察,而使得很難藉由在同一個反應中放入不同的引子對來同時檢測不同的產(chǎn)物。然而FISH可以利用不同的螢光蛋白,簡單的以顏色來分辨不同的目標序列。
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圖解:FLSH技術同時檢測五種不同基因產(chǎn)物果:蠅體內(nèi)的表現(xiàn)分布示意圖
3.對比一般PCR需要一定數(shù)量的細胞來萃取DNA/RNA進行反應,F(xiàn)ISH可以在單個細胞的數(shù)量級進行獨立的檢測,如圖三。這在諸如病毒感染、細胞病變或突變等領域的檢測及治療的評估扮演了重要的角色。
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圖解:HeLa Cell以不同劑量的siRNA處理,同時以FLSH技術偵測RNA/siRNA的量變化
在此以乳癌HER2基因的檢測說明FISH技術在臨床應用上的價值,HER2的全文為第二型人類表皮生長因子接受體,是一個在正常細胞中也會表現(xiàn)的基因。但是在癌癥細胞中此基因會被過度表現(xiàn)使得細胞表面有過多的生長因子接受體可以接受生長因子的刺激,致使細胞生長與分裂快速,表現(xiàn)出癌細胞的行為。乳癌病患中大約有25~30%為HER2陽性反應,由于其生長快速的特性使得治療的策略需要特別謹慎的選擇。因此HER2基因的檢測在乳癌病例中非常的重要,目前的檢測方式為免疫組織化學染色法與FISH兩階段的檢測方式。由操作快速、不需要螢光顯微鏡的IHC技術進行初步檢測。呈現(xiàn)弱陽性以上反應之檢體轉由FISH技術進行量化檢測,結果交由醫(yī)師與病患討論接續(xù)之治療方式。
FISH技術提供了基因表現(xiàn)定量與分布的檢測方式,并能以視覺化的方式被觀察。結合PCR、IHC、西方墨點法以及凝集反應等檢驗技術,可以讓我們對細胞層級的分子生物學與生物醫(yī)學研究有更多觀察的手段,并有更全面性的了解。

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